小樣發酵法檢測抗生素殘留

小樣發酵法抗生素殘留的檢測

國家明確規定生乳中不允許含有抗生素，所以抗生素常為乳及乳制品常規的檢測項目，其檢測方法也各式各異，其中生鮮牛乳小樣發酵法抗生素殘留的檢測方法作為一種有效、低成本、范圍廣的監控手段，被生產企業優先推廣使用，并在生產發酵乳的企業中使用尤為典型。

1、方法原理

選擇典型的乳酸菌菌種進行稀釋溶解后，采用無菌方式定量的加入到一定體積煮沸滅菌后的牛乳中，在一定的溫度下培養一定時間后，對牛乳的發酵情況進行檢測，以判定牛乳中是否含有抗生素。

2、材料與試劑

乳酸菌種、無新西蘭進口脫脂無抗奶粉、菌種、水浴鍋、300ml三角瓶、超凈臺、酒精燈、平皿、小勺、電子秤、電磁爐、保鮮柜、刻度吸管或移液管。

3、檢測步驟及判定

3.1母菌種的配置

復原乳的制備：新西蘭進口脫脂無抗奶粉與蒸餾水（溫度45℃~60℃）按照12%的比例配制成復原乳，55±1℃水合1小時后分裝到三角瓶中，采用水浴加熱滅菌待水沸騰后計時10分鐘，冷卻到42℃左右。在超凈臺（或無菌室）內加入粉菌種1.5g于250ml上述滅菌原料乳中制成母菌種，搖勻，保證菌種完全溶解，置于保鮮柜儲存備用。

發酵試驗的驗證：每次制備的母菌種需要用已知發酵成功的樣品進行驗證，驗證樣合格后可以投入使用。

以上配制母菌種整個過程耗時2小時。

3.2樣品檢測過程

將生乳樣品直接用電磁爐加熱沸騰后，移入滅菌的300ml三角瓶中，至三角瓶200ml刻度處，然后冷卻至45℃左右（以不燙手為準）。在酒精燈火焰旁用刻度吸管或者移液器在盛放樣品三角瓶中加入母菌種5mL，加塞后搖勻置于(45±1)℃水浴鍋內培養2.5小時或(45±1)℃水浴鍋內培養2.5小時，培養過程中不得搖動和晃動三角瓶。

培養結束后進行感官判定、觀察組織狀態后攪勻。

3.3檢測結果

小樣培養結束后，輕輕取出樣品瓶（不得對樣品瓶進行搖晃），直接觀察樣品狀態，如圖1凝固較結實、無乳清析出或有少量乳清析出則判為合格。

用力搖勻后，樣品在瓶壁的分布狀態均勻，掛壁時間較長，瓶壁上的牛奶緩慢流回，沒有明顯的塊狀顆粒，判為合格；反之樣品經過搖勻，不能均勻掛壁、出現有大量顆粒、結塊、絮狀、析水等現象均判定為不合格。

同時要求將搖勻后的材料倒入干燥且干凈的平皿中，轉動平皿使其分布均勻，觀察狀態。材料狀態應光滑細膩，如出現有大顆粒、結塊、絮狀、析水等現象，均判定為不合格。參見圖5、圖6、圖7。

備注：小樣發酵實驗，除上述外觀檢驗，還有酸度及粘度檢測。

酸度檢測方法使用GB 5009.239-2016酚酞指示劑法；粘度檢測選用型號為DV-II+型數顯粘度計，轉子選用92號，轉速選用5％，10秒，待粘度穩定后讀數。

4、注意事項

（1）菌種使用前需將其碾成粉末狀，混勻后盡量用小勺加入，且注意小勺溫度不能太高以免殺死菌種，用后袋裝菌種及時將口封嚴（如果用火焰封口，不可燒到里面的菌種），冷凍或依據菌種說明保存。

（2）滅菌原料乳冷卻至在42℃左右，待菌種溶解后靜置5～10分鐘，保證菌種與復原乳徹底融合。

（3）母菌種配制好后需在保鮮柜（2～8）℃中保存，48小時內使用，超過48小時如繼續使用需要用合格樣品做對比，對比合格后方可使用。

（4）如果母菌種出現發酵變酸變粘現象，需要驗證菌種的活性，合格后使用，但最好重新配制。