植物組織原位雜交電話 武漢思特進

原位雜交技術基本原理

原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。

為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物。

雜交流程

雜交液的成分主要影響了核酸雜交的復性動力學和熱穩定性。雜交液的基礎成分為：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），異源核酸（如鯡精3子DNA/tRNA/競爭DNA），磷酸鈉，EDTA，SDS，鹽離子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及雜交探針。不同的應用中進行雜交溫度、pH、鹽離子、甲酰胺、探針濃度等條件的優化。常用的pH范圍為6.5~7.5，較高的pH值有助于提高雜交的嚴謹性。

雜交液中的陽離子濃度通過靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩定性，較高的鹽濃度將增加雜交體的穩定性。大于0.4M的Na離子濃度，對Tm值、雙鏈復性速率的影響不大，但隨著Na離子濃度的降低，將顯著影響Tm值和雙鏈復性速率。

有2機溶2劑（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na 90~100℃的條件下變性，那么應用于原位雜交，樣品必須在65~75℃的條件下進行長時間變性，這將導致樣品形態學的破壞。50%甲酰胺的應用能將雜交溫度降至30~45℃。

硫酸葡聚糖具有很強的水合性，高濃度的硫酸葡聚糖會使得核酸分子無法獲得周邊親水環境，增加了探針濃度，加快雜交反應速率。