熒光定量pcr實驗室外包「英瀚斯」

分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。12000r/min于4C離心5min,小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10~15min。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。目前主要使用Sybrgreen和taqman法對RNA含量進行檢測。

實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。

結果示例：

圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化

從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

凝膠阻滯遷移電泳檢測服務（EMSA）

凝膠遷移或電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種研究DNA/RNA結合蛋白和其相關的DNA/RNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。依據實驗需要，設計標記探針、非標記探針、蛋白特異性抗ti等參照物，基于DNA-蛋白質或RNA-蛋白質復合體在聚bing烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理，當轉錄因子與特異的DNA或RNA結合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結合核蛋白轉錄因子的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結合的蛋白轉錄或調節因子。如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現在的華大基因。

RNA提取處理的步驟如下：

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強的物，須在通風櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時以上。