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發(fā)布時間:2020-12-30 08:16  





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在前PCR區(qū)建立PCR混合物:
⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃,在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。
⑵如果你的實驗室使用多套引物,以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟,可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
⑶作為一個規(guī)則,應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且,你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。
⑷陰性樣品要與每組樣品同時做,以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染,陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。
⑸當(dāng)做陽性對照時,有兩個理由決定了應(yīng)該使用很少數(shù)量的核酸。
⑹由于必須有對照反應(yīng),對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。
擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為DNA擴增。此外,已制備的DNA模板 (來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。
本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓,以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。
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對于全新的空調(diào)機組,在進氣口處安裝一個鋁制過濾網(wǎng),應(yīng)至少每周清潔一次。在pcr實驗室凈化中,如果絮狀物和灰塵漂浮,它們應(yīng)該每周清洗兩次。在拉出鋁網(wǎng)之前,需要關(guān)閉新鮮空氣裝置,清潔后的過濾器只有在干燥后才能安裝。在聚合酶鏈反應(yīng)純化過程中,檢查風(fēng)機冷凝水管道是否堵塞,氣封中是否有積水。風(fēng)扇表面冷卻器下方有一個集水盤,用于接收冷凝水,冷凝水通過帶空氣密封的管道排放到地漏處。
如果在pcr純化過程中排水冷凝管被堵塞,水將在機柜中積聚,這將導(dǎo)致細菌繁殖并影響純化效果。空氣密封的功能是防止排水管外的空氣通過排水管彎頭處積聚的水回流到類似于風(fēng)扇中的洗滌池的水封,這可用于防止臭氣溢出。因此,在pcr實驗室的凈化過程中,當(dāng)冬季沒有冷凝水時,應(yīng)注意檢查氣封中積聚的水是否干燥,如果干燥,應(yīng)及時加入清水,使其保持水封狀態(tài)。
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PCR實驗室各區(qū)域儀器設(shè)備配備通常如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)的PCR實驗室試劑準(zhǔn)備區(qū): 儀器設(shè)備主要應(yīng)有加樣器、冰箱、天平、低速離心機、混勻器、可移動紫外燈等。可使用超凈工作臺作為試劑配制操作臺面。
2、標(biāo)準(zhǔn)的PCR實驗室標(biāo)本制備區(qū)儀器設(shè)備主要應(yīng)有生物安全柜(為B2, 可避免提取核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán),造成標(biāo)本間交叉“污染”,出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
此外還應(yīng)配備加樣器、臺式高速離心機(冷凍及常溫)、臺式低速離心機、恒溫設(shè)備(水浴和干浴儀)、冰箱、混勻器和可移動紫外燈等。