pcr引物設(shè)計消化系統(tǒng)模型「英瀚斯」

腺病毒包裝原理介紹

腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個 殼粒呈二十面體排列構(gòu)成。染色質(zhì)免l疫沉淀分析(ChIP)的基本原理是在活l細胞狀態(tài)下，當(dāng)用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產(chǎn)生共價鍵。每個殼粒的直徑為7-9nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，兩端各有長約100bp的反向重復(fù)序列。人體腺病毒 已知有33種，分別命名為ad1-ad33，研究詳細得是ad2.

腺病毒是一種無包膜的球型結(jié)構(gòu)的病毒，遺傳物質(zhì)為線型 雙股DNA形式。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2。腺病毒的特點：（1）gan染范圍廣對人致病性低；（2）對增殖和非增殖細胞均具有g(shù)an染性；（3）能有效進行增殖；（ 4）病毒滴度高；（5）不整合到染色體中，無插入致突變性；(6)外源基因裝載容量大。由于腺病毒的這些特點使其廣泛地應(yīng)用于體 外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種yi苗、和基因zhi療等各個領(lǐng)域。

實驗方法

1.獲得目的基因序列；

2.構(gòu)建病毒表達載體質(zhì)粒；

3.表達載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒重組；

4.gan染HEK293，包裝出病毒；

5.病毒擴增、濃縮；

6.滴度測定。

DNA測序檢測

1. PCR測序反應(yīng)

(1)取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑:

所加試劑測定模板管標(biāo)準(zhǔn)對照管

BigDye Mix

1μl

待測的質(zhì)粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf ( )雙鏈DNA

-1μ1

待測DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

滅菌去離子水

2μ 1

總反應(yīng)體積5μ 1,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀.上進行擴增。98C變性2min后進行PCR循環(huán)，

PCR循環(huán)參數(shù)為96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4C保溫。

2.乙醇法純化PCR產(chǎn)物

(1) 將混合物離心，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C離心30 min,小心棄上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗滌沉淀2次。12 000r/min 于4C離心5min,小心棄上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理。

(1)加入12μ 1的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。

(2)將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。

(3)在PCR儀上進行熱變性(95C 2min),冰中驟冷，待_上機。

4..上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立

運行的測序順序文件。

5.儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過

序列比較以星號標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。

6.測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)。

外顯子測序

外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。

如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。實驗流程：細胞收集-細胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照結(jié)果示例：圖A不同大小的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，Westernblot檢測圖片。該研究結(jié)果發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測序平臺對同一個人類血液樣品進行分析。他們的結(jié) 果表明，NimbleGen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80M測序數(shù)據(jù)的情況下，NimbleGen有97%的目標(biāo)序列達到10x以上的測序深度，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序（WGS），顯示外顯子組測序能夠檢測到WGS錯過的小變異。

除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。腺相關(guān)病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以滿足各類整體實驗的使用要求。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。

基因組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -種比較傳統(tǒng)的方法,是根據(jù)DNA或蛋白分子量和構(gòu)象的不同而使其加以分離。據(jù)估計,在人類基因組中,大約每千個堿基中有一個SNP,無論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標(biāo)記(STR),都要廣泛得多。由于在動態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統(tǒng)的壓強的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲l基化水平。該方法由Ruo等1980年首l次報道。過程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5 mC/(5mC 5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。這是一種檢測DNA甲l基化水平的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.高l效毛細管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細管來從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。往每個EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s，冰上靜置12min[問l。其基礎(chǔ)是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開。用HIPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來確定5mC水平，簡便，經(jīng)濟且敏感性高。