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核酸試劑盒

核酸檢測試劑盒為什么會出現(xiàn)漏檢？

大家在新聞上看到過核酸檢測出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象，這是為什么呢？首先，我們對病毒認(rèn)識不足，疾病進展目前都不清楚，這就可能導(dǎo)致采樣時間不合適，從而漏檢。第二，每個人的抵抗力不同，同樣都有了病毒，但有的人能快速地清除病毒，體內(nèi)病毒量少，自然不易檢出。第三，試劑盒有自身的靈敏度限制，也就是說樣本中的病毒量少到一定程度，試劑盒是檢測不出來的，這是核酸檢測技術(shù)上的限制，另外，樣本采集是否規(guī)范、轉(zhuǎn)運保存是否恰當(dāng)?shù)纫蛩囟紩绊懺噭┖械年栃詸z出率。

RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，反應(yīng)溫度在37°C左右。

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。RPA擴增的基礎(chǔ)體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要準(zhǔn)備好引物和模板就行。擴增結(jié)果可以通過凝膠電泳進行終點檢測，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。

在這個基礎(chǔ)體系中添入不同的酶和探針，就可以實現(xiàn)多樣化的RPA應(yīng)用。舉例來說，TwistAmp? exo結(jié)合了exo探針技術(shù)和核酸外切酶III，能實現(xiàn)數(shù)據(jù)的實時讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應(yīng)終點的擴增子總量有所減少，適合獲得強熒光信號進行動力學(xué)分析，不適合終點檢測(比如跑膠)。將exo探針技術(shù)、核酸外切酶III和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合起來，可以一步實現(xiàn)RNA模板的實時擴增。

等溫核酸試劑盒

目前，核酸檢測方法主要包括PCR法、恒溫擴增法、測序法、CRISPR檢測法等。其中，第二代PCR技術(shù)是病毒檢測方法的主流方法，也是目前認(rèn)可的SARS-CoV-2測定方法。第二代PCR技術(shù)，又稱熒光PCR法，是指在反應(yīng)體系中加入了熒光物質(zhì)，通過專門儀器實現(xiàn)實時熒光檢測，并對模板進行定量計算。為了增加靈敏度和特異性，熒光PCR法出現(xiàn)了不少改進版本，包括Taqman探針法、雙重或多重?zé)晒釶CR等。