動物組織原位雜交電話「思特進」

間接標記的方法中應(yīng)用了報告分子標記的探針，報告分子通過親和酶促的方法進行顯色。常用的報告分子如地高6辛，生物素。結(jié)合地高6辛抗6體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進行間接的底物反應(yīng)檢測。地高6辛標記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時使用的地高6辛抗6體不會結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標記系統(tǒng)的優(yōu)勢。地高6辛抗6體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應(yīng)用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測結(jié)果。但需注意，由于引入了免6疫檢測反應(yīng)，在放大檢測靈敏度的同時，應(yīng)注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測背景。

通過不同標記方法的聯(lián)合應(yīng)用，還可在同一樣本中實現(xiàn)染色體不同區(qū)域或細胞樣本中不同RNA序列的多重檢測。

原位雜交 (ISH) 是用于定位固定組織和細胞中特定核酸靶標的強大技術(shù)，能夠獲得與基因表達和遺傳位點相關(guān)的時間和空間信息。 雖然ISH的基本工作流程與印跡雜交近似，即核酸探針被合成、標記、純化和特異性靶標退火，但其不同之處在于前者可通過可視化顯示組織內(nèi)的結(jié)果來獲得更多信息。 如今有兩種基本方法來實現(xiàn)可視化顯示原位RNA和DNA靶標，即熒光 (FISH) 和顯色 (CISH) 檢測。 每種檢測方法本身的特點（見下表）使得FISH和CISH適用于截然不同的應(yīng)用。 雖然兩種方法均使用標記的、與樣本雜交的靶標特異性探針，但每種方法用于可視化顯示樣本的儀器不同。 這里我們將強調(diào)每種方法的不同之處和各自的優(yōu)勢。

武漢思特進科技發(fā)展有限公司成立于2007年，是一家以實驗技術(shù)研發(fā)、實驗產(chǎn)品研發(fā)、日化產(chǎn)品研發(fā)、實驗項目承接為一體的高新技術(shù)公司；公司實驗中心有分子生物學(xué)平臺、細胞平臺、光鏡平臺、植物組培平臺、原核蛋白表達平臺、日化產(chǎn)品生產(chǎn)平臺；可以開展各類動、植物、細菌、細胞等生物實驗。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應(yīng)時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復(fù)性。Tm值25℃時雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。



根據(jù)不同的雜交實驗要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克0隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應(yīng)選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克0隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。