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ELISA試劑盒的測試要求

做好對照

正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)。

實驗條件的選擇

在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被（或抗原）的選擇：將（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。

（3）酶標(biāo)記工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標(biāo)記部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

Elisa試劑盒實驗原理

將目標(biāo)包被于微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的目標(biāo)連接于固相載體上的結(jié)合，然后加入微生物化的目標(biāo)，將未結(jié)合的生物素洗凈后，加入HRP標(biāo)記和親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)呈正相關(guān)。在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計算樣品濃度。

Elisa試劑盒操作步驟

1、固相載體的挑選：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。

2、包被或抗原的挑選：將或抗原吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。

3、 酶標(biāo)記作業(yè)濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法'，在正式試驗體系里準(zhǔn)確地滴定其作業(yè)濃度。

4、酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。