實時熒光定量pcr細胞株構建 英瀚斯

分子生物學服務

 公司建有100平米分子實驗室，配備有PCR儀、定量PCR儀、電泳儀、恒溫培養箱、恒溫搖床、垂直電泳儀、蛋白轉印儀、蛋白發光成像儀等設備。技術優勢信息覆蓋廣泛：覆蓋了多個quan威lncRNA數據庫發布的數據。分子組技術人員畢業于中國農業大學、華中科技大學同濟醫學院、浙江理工大學等高校生物醫學相關專業，全部具有碩士研究生以上學歷，熟練掌握分子生物學相關實驗，可開展多種分子生物學檢測服務。

分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。但是長期以來，大規模的蛋白質表達分析譜并沒有提升我們對生物標志物的認識，其主要原因是差異蛋白的分析結果缺乏規模化的驗證。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。分子組技術人員畢業于中國農業大學、華中科技大學同濟醫學院、浙江理工大學等高校生物醫學相關專業，全部具有碩士研究生以上學歷，熟練掌握分子生物學相關實驗，可開展多種分子生物學檢測服務。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。

實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。

結果示例：

圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化

從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

腺病毒包裝原理介紹

腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個 殼粒呈二十面體排列構成。若miRNA與mRNA的結合位點不配對，則抑制mRNA的翻譯。每個殼粒的直徑為7-9nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，兩端各有長約100bp的反向重復序列。人體腺病毒 已知有33種，分別命名為ad1-ad33，研究詳細得是ad2.

腺病毒是一種無包膜的球型結構的病毒，遺傳物質為線型 雙股DNA形式。目前國內采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制訂的行業標準。腺病毒的特點：（1）gan染范圍廣對人致病性低；（2）對增殖和非增殖細胞均具有gan染性；（3）能有效進行增殖；（ 4）病毒滴度高；（5）不整合到染色體中，無插入致突變性；(6)外源基因裝載容量大。由于腺病毒的這些特點使其廣泛地應用于體 外基因轉導、體內接種yi苗、和基因zhi療等各個領域。

實驗方法

1.獲得目的基因序列；

2.構建病毒表達載體質粒；

3.表達載體質粒和包裝質粒重組；

4.gan染HEK293，包裝出病毒；

5.病毒擴增、濃縮；

6.滴度測定。

轉錄組重測序      

      轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有mRNA的總和。STR是以核心序列(corerepeatunits)首尾相連多次重復形成。轉錄組研究是基因功能及基因結構等研究的基礎，通過新一代高通量測序，能夠快速的獲得某一物種特定組織或在某一狀態下的幾乎所有轉錄本序列信息，已廣泛應用于臨床診斷、基礎研究和研發等領域。

     轉錄組Resequencing針對的是有參考基因組的物種。用新一代高通量測序技術對某物種的特定組織或細胞進行轉錄組測序，與參考基因組比較，可以得到基因表達差異、可變剪接、融合基因等遺傳調控信息。