紹興PCR質粒構建 英瀚斯生物科技

慢病毒包裝

1、細胞準備：細胞傳到后，密度達到70％左右時進行轉染；

2、細胞轉染:取兩個EP管，一個加入Opti-MEM、核心質粒和包裝質粒；另一個加入Opti-MEM、lipo2000，然后將兩管混勻；

3、細胞孵育：將混合液逐滴加入細胞培養皿中，混勻后孵育；

4、收集病毒：轉染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

5、滴度檢測:細胞為30%－50％時加入病毒上清液，檢測陽性細胞比例。

甲l基化特異性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生jia基化的胞嘧定被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設計針對jia基化和非jia基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理后jia基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在jia基化；反之，說明被檢測的位點不存在jia基化。

特點：適用范圍廣，能夠檢測特異位點是否發生jia基化。

亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing確度高，能明確目的片段中每一個 CpG 位點的jia基化狀態。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生jia基化的胞嘧ding被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生jia基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產物克long至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-ke隆測序法。

特點：jing確度高，能夠準確檢測出jia基化的程度百分比。

STR檢測

短串聯重復(Short tandem repeats, STR)，又稱微wei星DNA(Microsatellite DNA)或簡單重復序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的核苷酸重復序列。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認為是導致STR產生的較為常見原因，并且依據不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發生的概率也不相同。

STR是以核心序列 (core repeat units) 首尾相連多次重復形成。每個STR的核心序列結構相同，長度為2-6bp，但其重復單位數目和重復區域的長度不同，因此STR在不同種族、不同人群之間的分布具有差異性，構成了STR遺傳多態性。不同個體之間在一個同源STR位點的重復次數也不同，因而同指紋識別一樣，STR位點分析也可對個體進行身份識別。通過識別個體基因組在特定位點的特定序列重復，即可創建其基因檔案。基于此，STR分析法已經成為一種重要的鑒定分析方法，應用于法醫學、qin子鑒定及細胞鑒定等領域。