浙江pcr實驗室實驗室外包「英瀚斯」

免yi共沉淀（Co-IP檢測）是以抗ti和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質與蛋白質間的相互作用也被保留下來。用預先固化在beads上的蛋白質A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來，再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生jia基化的胞嘧定被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變。

動物組織細胞基因組DNA提取

操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另

一離心管中。

2.加2倍體積異，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）

3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存備用。

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%，產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。外顯子測序外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

17.如果測序發現突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯系，生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑zhi劑(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。