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人工酶與限制酶的區別是什么？

生物體內的天然酶都是由幾百個氨基酸分子組成的蛋白質。酶所以有那么強的催化作用，跟它特有的結構有關。酶有一個活化中心，即它的催化基因。在化學反應中，催化基因處在兩個底物小分子中間，把兩個小分子緊緊地拉在周圍，使它們結合起來。這就好比一個大人的兩只手拉住兩個小孩使他們親近。酶的這種作用能大大加速生物化學反應。

在細菌內存在的一類能識別并水解外源DNA限制性內切酶，它具有很好的專一性，能識別DNA上的特定位點，將DNA的兩條鏈都切斷，形成黏性末端或平末端。DNA經限制酶切割后產生的具有堿基互補單鏈的末端稱為黏性末端。限制酶的生物學功能在于降解外面侵入的DNA而不降解自身細胞中的DNA，因自身DNA的酶切位點經修飾酶的甲1基化修飾而受到保護。限制酶較為穩定，常用的約100多種并已轉化為商品。限制酶在分析染色體結構、制作DNA的限制酶圖譜、測定較長DNA序列以及基因的分離、基因的體外重組等研究中是不可缺少的重要工具酶。

限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類：

Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾（甲1基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。

Ⅱ類由兩種酶組成： 一種為限制性內切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨立的甲1基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克1隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少數酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA部分片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA部分片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。

質粒載體和外源ＤＮＡ中限制酶切位點的性質

    如今，質粒載體中限制酶切位點的種類極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點恰恰與外源ＤＮＡ部分片段本身毫無二致的載體。這就具備一個不可1比擬的優點，也應是可以用相應的限制酶消化重組質粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產生匹配末端的任何位點中。例如，識別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ部分片段可以克1隆到用BanHl消化的質粒中。這通常會使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開。然而很多清況下，用切點位于多克1隆序列側翼的限制酶進行消化，可將片段從重組質粒中摘出。偶爾在質粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點之間，不可能找到“門當戶對”的搭配關系。這時可用下面兩種方案加以解決：

   1）在線狀質粒末端和（或）外源ＤＮＡ部分片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。

   2）在得到控制的反應條件下，用大腸桿1菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補平帶3凹端的ＤＮＡ部分片段。如第九章所討論，這樣常可以使那些不相匹配的限制酶切位點轉變為互補末端，從而促進載體和外源ＤＮＡ的連接。因為部分補平的反應消除了同一分子兩端彼此配對的能力，故連接反應過程中環化和自身寡聚化的機會也會有所降低

藍白斑篩選鑒定

　　用于克1隆的酶還須通過額外的質量鑒定――藍白斑篩選鑒定，以確定經酶過量消化后DNA末端的完整性。該種鑒定方法為：用酶10倍過量消化適當的載體上lacZ基因中單一的酶切位點，連接，轉化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、連接和表達b-galactosidase可以說明克1隆后基因是完整的，一個完整的基因產生藍斑，一個不完整的基因(例如，降解的DNA末端)產生白斑。在進行藍白斑鑒定中，所有的限制性內切酶產生的白斑數量不應超過3%。