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發布時間：2020-11-16 05:58
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1.抗活性Arf 6，小鼠單克l隆抗l體（貨號26918）：一小瓶– 22 μL（1
含50％甘油和0.05％疊氮l化鈉的PBS（pH 7.4）中的濃度（mg / ml）。 該抗l體特異性識別所有脊椎動物的Arf 6-GTP。
2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。
3. 5X測定/裂解緩沖液（目錄號30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。
4.抗Arf 6，兔多克l隆抗l體（貨號21032）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）
pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。
5. 100 XGTPγS（目錄號30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγS標記0.5 mL細胞裂解液。
6. 100 X GDP（產品目錄號30304）：一個樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP標記0.5 mL細胞裂解物。
陽性對照和陰性對照的體外GTPγS/ GDP蛋白質上樣量
注意：體內細胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負載將激l活Arf 6的將近90％。
1，將0.5 ml每種細胞提取物等分到兩個微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。
2，向每個試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。
3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個試管中（陽性對照）。
4，在第二個試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對照）。
5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。
6，通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來停止加載。
測定步驟
I.主動Arf 6下拉分析
1.將0.5 – 1 mL細胞裂解液等分到微量離心管中。
2.使用1X分析/裂解緩沖液將每個樣品的體積調整為1 mL。
3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6單克l隆抗l體。
4.通過渦旋或滴定徹底重懸蛋白A / G瓊脂糖珠漿。
5.快速向每個管中添加20 μL重懸浮的珠漿。
6.輕輕攪拌將試管在4°C下孵育1小時。
7.通過以5,000 x g離心1分鐘來沉淀小珠。
8.吸出并丟棄上清液，確保不要干擾/除去珠粒。
9.用0.5 mL的1X Assay / Lysis Buffer洗滌磁珠3次，每次離心并吸出。
10.后一次洗滌后，將珠粒沉淀并小心除去所有上清液。
11.將磁珠沉淀重懸于20 μL 2X還原SDS-PAGE樣品緩沖液中。
12.將每個樣品煮沸5分鐘。
13.以5,000 x g的速度離心每個樣品10秒鐘。
