自貢PCR實(shí)驗(yàn)室擇優(yōu)推薦「多圖」

Southern雜交

實(shí)驗(yàn)原理

      Southern印跡雜交（Southern blot）是1975年由英國(guó)人southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。RNAi提供了一種經(jīng)濟(jì)、快捷、gao效的抑制特異基因表達(dá)的技術(shù)手段,該技術(shù)已被廣泛用于研究基因功能和chuan染性疾病及惡xingzhong瘤基因zhi療領(lǐng)域。Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNAl片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNAl片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放l射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測(cè)特定DNA分子的含量。

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過(guò)夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過(guò)的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時(shí)以上。

25.PCR擴(kuò)增不出就引物有問(wèn)題嗎？

答：基本不是。據(jù)估計(jì),在人類(lèi)基因組中,大約每千個(gè)堿基中有一個(gè)SNP,無(wú)論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標(biāo)記(STR),都要廣泛得多。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來(lái)解決PCR擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出、擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。如巢式PCR就是擴(kuò)增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴(kuò)增, GC含量高的片段，非要采用特殊擴(kuò)增手段才能擴(kuò)增出了。

引物擴(kuò)增不出，主要是下列兩種情況比較常見(jiàn)：

（1） RT-PCR。請(qǐng)注意，很多基因通過(guò)常規(guī)RT -PCR方法是很難擴(kuò)增出來(lái)的。 RT- PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標(biāo)基因在特定組織和細(xì)胞中含量。

（2）從基因組中擴(kuò)增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量。基因組DNA過(guò)高，會(huì)影響反應(yīng)體系中的Mg和pH